Esterilización > Generalidades

  • Esterilización: eliminación o muerte de todos los microorganismos que contiene un objeto o sustancia, y que se encuentran acondicionados de tal forma que no pueden contaminarse nuevamente.
  • Sanitizante: agente que disminuye la carga microbiana total a un nivel el cual es seguro para la salud de la población. Sólo es aplicable sobre objetos inanimados.
  • Desinfectante: agente que elimina la carga microbiana total en superficies inanimadas tales como habitaciones.
  • Antiséptico: agente que controla y reduce la presencia de microorganismos potencialmente patógenos sobre piel y/o mucosas (sólo pueden aplicarse externamente sobre seres vivos).

 

Agentes antibacterianos esterilizantes y/o desinfectantes

1.       Provocan pérdida de la viabilidad en los microorganismos

·         Físicos (calor, radiaciones)

·         Químicos (óxido de etileno, formaldehído, agentes oxidantes, soluciones antisépticas.)

 

2.       Provocan una separación de los microorganismos de la sustancia líquida

·         Filtración (se eliminan los microorganismos presentes en un fluido).

 

 

Esterilización > Agentes físicos

Calor

Todos los microorganismos son susceptibles, en distinto grado, a la acción del calor. El calor provoca desnaturalización de proteínas, fusión y desorganización de las membranas y/o procesos oxidativos irreversibles en los microorganismos.

La efectividad del calor como método de esterilización depende de:

  • Temperatura
  • Tiempo de exposición

 

Calor Húmedo

El calor húmedo produce desnaturalización y coagulación de proteínas. Estos efectos se deben principalmente a dos razones:

  • El agua es una especie química muy reactiva y muchas estructuras biológicas (DNA, RNA, proteínas, etc) son producidas por reacciones que eliminan agua. Por lo tanto, reacciones inversas podrían dañar a la célula a causa de la producción de productos tóxicos. Además, las estructuras secundarias y terciarias de las proteínas se estabilizan mediante uniones puente de hidrógeno intramoleculares que pueden ser reemplazadas y rotos por el agua a altas temperaturas.
  • El vapor de agua posee un coeficiente de transferencia de calor mucho más elevado que el aire. Por lo que, los materiales húmedos conducen el calor mucho más rápidamente que los materiales secos debido a la energía liberada durante la condensación.

El autoclave es el aparato más comúnmente utilizado en los laboratorios para esterilizar cultivos y soluciones que no formen emulsiones con el agua y que no se desnaturalicen a temperaturas mayores a 100 °C. Una temperatura de 121 °C (una atmósfera de sobrepresión) con un tiempo de exposición mayor a 15 minutos sirve para destruir organismos formadores de esporas.

 

Presión
[atm]

Temperatura
[°C]

Descarga completa del aire

Descarga de 2/3 del aire

Descarga de 1/2 del aire

Sin descarga del aire

1/3

109

100

90

72

2/3

115

109

100

90

1

121

115

109

100

4/3

126

121

115

109

5/3

130

126

121

115

2

133

130

126

121

Influencia de la descarga incompleta de aire en la temperatura del autoclave

 

Ventajas

  • Rápido calentamiento y penetración
  • Destrucción de bacterias y esporas en corto tiempo
  • No deja residuos tóxicos
  • Hay un bajo deterioro del material expuesto
  • Económico

 

Desventajas

  • No permite esterilizar soluciones que formen emulsiones con el agua
  • Es corrosivo sobre ciertos instrumentos metálicos

 

Calor Seco

El calor seco produce desecación de la célula, efectos tóxicos por niveles elevados de electrolitos, procesos oxidativos y fusión de membranas. Estos efectos se deben a la transferencia de calor desde los materiales a los microorganismos que están en contacto con éstos. El aire es mal conductor del calor, y el aire caliente penetra más lentamente que el vapor de agua en materiales porosos. La acción destructiva del calor sobre proteínas y lípidos requiere mayor temperatura cuando el material está seco o la actividad de agua del medio es baja. Esto se debe a que las proteínas se estabilizan mediante uniones puente de hidrógeno intramoleculares que son más difíciles de romper por el calor seco.

La estufa de esterilización es el artefacto utilizado en los laboratorios para esterilizar por calor seco. Se requiere mayor temperatura y tiempo de exposición que el autoclave. La temperatura varía entre 120° y 180°C, requiriéndose distintos tiempos de exposición. A 140°C se necesitan por lo menos 5 horas de exposición, mientras que a 160°C se requieren al menos 2 horas de exposición.

Sirve para esterilizar material de vidrio. El papel y el algodón no pueden ser esterilizados a más de 160°C.

Ventajas

  • No es corrosivo para metales e instrumentos.
  • Permite la esterilización de sustancias en polvo y no acuosas, y de sustancias viscosas no volátiles.

 

Desventajas

  • Requiere mayor tiempo de esterilización, respecto al calor húmedo, debido a la baja penetración del calor.

Existen otras formas de eliminar microorganismos por calor seco. La incineración se utiliza para destruir material descartable contaminado. La acción directa de la llama elimina a los microorganismos cuando se lleva al rojo el material de metal como ansas, lancetas, agujas de disección.


Radiaciones

Su acción depende de:

  • Tipo de radiación
  • Tiempo de exposición
  • Dosis

 

Ionizantes

Producen iones y radicales libres que alteran las bases de los ácidos nucleicos, estructuras proteicas y lipídicas, y componentes esenciales para la viabilidad de los microorganismos.

Tienen gran penetrabilidad y se las utiliza para esterilizar materiales termolábiles (termosensibles) como jeringas descartables, sondas, etc. Se utilizan a escala industrial por sus costos.

No se utilizan para medios de cultivo o soluciones proteicas porque producen alteraciones de los componentes.

 

Ultravioletas

Afectan a las moléculas de DNA de los microorganismos debido a que forman dímeros de pirimidinas adyacentes que inducen errores en la duplicación y por lo tanto la pérdida de la viabilidad de las células.

Son escasamente penetrantes y se utilizan para superficies.

 

 

 

 

 

Esterilización > Agentes químicos

Dentro de los compuestos químicos podemos encontrar agentes esterilizantes, desinfectantes y antisépticos.

La efectividad de estos agentes depende de las condiciones bajo las que actúan.

  • Concentración: varía con el tipo de agente y de microorganismo, pues una misma concentración del agente puede producir un efecto diferente en distintos microorganismos.
  • Tiempo: los microorganismos no son susceptibles a un agente en la misma forma, por lo que no todos los microorganismos mueren al mismo tiempo.
  • pH: afecta tanto a los microorganismos como a los agentes químicos. El aumento de pH por encima de 7 incrementa la carga negativa de los microorganismos afectando la concentración del agente sobre la célula. El pH determina el grado de disociación y la efectividad del agente químico, pues a menor disociación mayor permeabilidad y mayor efectividad.

 

Antisépticos

Alcoholes

Iodo

Agentes catiónicos, aniónicos y anfóteros

Organo Mercuriales

Colorantes

Desinfectantes y/o Esterilizantes

Cloro y Compuestos clorados

Aldehídos

Oxido de Etileno

Compuestos Fenólicos

Acidos y Alcalis

 

Antisépticos

Alcoholes

Lesionan la membrana celular de los microorganismos y desnaturalizan proteínas celulares. Desorganizan la estructura fosfolipídica.

No destruyen esporas y tienen una acción germicida lenta. Los alcoholes de cadena corta tienen un efecto nocivo mayor que los de cadena larga.

Se utilizan en concentraciones del 50 al 70%. Los más utilizados son el etanol e isopropílico.

 

Iodo

Es un agente oxidante que modifica grupos funcionales de proteínas y ácidos nucleicos. Inactiva proteínas y enzimas por oxidación de los grupos -SH a S-S, pudiendo atacar también grupos amino, indoles, etc.

Se utiliza como desinfectante de la piel (tintura de iodo: yodo molecular 2% y yoduro de sodio 2% en alcohol), aunque es irritante.

Es efectivo contra esporas en una concentración de 1600 ppm de iodo libre.

 

Agentes iónicos y anfóteros

Son sustancias que lesionan la membrana celular debido a que desordenan la disposición de las proteínas y de los fosfolípidos, por lo que se liberan metabolitos desde la célula, se interfiere con el metabolismo energético y el transporte activo.

No son esporicidas ni tubercolicidas aún en altas concentraciones. Sus principales ventajas se hallan en que son inodoros, no tiñen, no son corrosivos de metales, estables, no tóxicos y baratos.

  • Catiónicos: Sales de amonio cuaternarias. Tienen mayor actividad a pH alcalino y los Gram + son más susceptibles.
  • Aniónicos: Jabones y ácidos grasos. Tienen mayor actividad a pH ácido y son eficaces contra Gram +.
  • Anfóteros: Actúan como catiónicos o aniónicos según el pH.

 

Organo Mercuriales

Estos tipos de compuestos se combinan con los grupos -SH de las proteínas, inactivando enzimas. Dentro de los mercuriales orgánicos se encuentran el metafen y el mertiolate.

 

Peróxido de Hidrógeno

Es un antiséptico débil, con capacidad oxidante y formadora de radicales libres.

Actualmente, el peróxido de hidrógeno gaseoso se está utilizando como desinfectante de superficies o descontaminante de gabinetes biológicos debido a que no posee las propiedades tóxicas y cancerigenas del óxido de etileno y formaldehído.

 

Colorantes

Interfieren en la síntesis de ácidos nucleicos y proteínas (acridina) o interfieren en la síntesis de la pared celular (derivados del trifenilmetano). La acridina se inserta entre dos bases sucesivas del DNA separándolas físicamente. Esto provoca errores en la duplicación del DNA. Los derivados del trifenilmetano (violeta de genciana, verde de malaquita y verde brillante) bloquean la conversión del ácido UDP-acetilmurámico en UDP-acetilmuramil-péptido.


R = HSO4- Verde Brillante
R = Cl- Verde de Malaquita


Violeta de Genciana

 

Desinfectantes y/o Esterilizantes

Cloro

El cloro, los hipocloritos y las cloraminas son desinfectantes que actúan sobre proteínas y ácidos nucleicos de los microorganismos. Oxidan grupos -SH, y atacan grupos aminos, indoles y al hidroxifenol de la tirosina.

El producto clorado más utilizado en desinfección es el hipoclorito de sodio (agua lavandina), que es activo sobre todas las bacterias, incluyendo esporas, y además es efectivo en un amplio rango de temperaturas.

La actividad bactericida del hipoclorito de sodio se debe al ácido hipocloroso (HClO) y al Cl2 que se forman cuando el hipoclorito es diluido en agua. La actividad germicida del ion hipocloroso es muy reducida debido a que por su carga no puede penetrar fácilmente en la célula a través de la membrana citoplamática. En cambio, el ácido hipocloroso es neutro y penetra fácilmente en la célula, mientras que el Cl2 ingresa como gas.

El hipoclorito de sodio se comercializa en soluciones concentradas (50-100 g/l de Cloro activo), a pH alcalino y en envases oscuros que favorecen su estabilidad, pero es inactivo como desinfectante. A causa de ésto, es que deben utilizarse soluciones diluidas en agua corriente (que tiene un pH ligeramente ácido), con el objeto de obtener ácido hipocloroso. Generalmente, se utilizan soluciones con una concentración del 0.1-0.5% de Cloro activo.

Su actividad está influida por la presencia de materia orgánica, pues puede haber en el medio sustancias capaces de reaccionar con los compuestos clorados que disminuyan la concentración efectiva de éstos.

 

Aldehídos

Son agentes alquilantes que actúan sobre proteínas, lo que provoca modificación irreversible de enzimas e inhibición de la actividad enzimática (Adición nucleofílica de grupos -NH2 y -SH). Se utilizan como desinfectantes y esterilizantes. Destruyen esporas.

El glutaraldehído es el único esterilizante efectivo en frío. El formaldehído como gas se utiliza para descontaminar edificios, ambientes, etc. El formaldehído gaseoso se obtiene por calentamiento del paraformaldehído (OH (CH2O)n-H), lo que produce las despolimerización de este compuesto y la liberación de formaldehído.

El formaldehído tiene la desventaja de ser muy irritante y perder actividad en ambientes refrigerados.

 

Compuestos Fenólicos

Son desinfectantes que provocan lesiones en la membrana citoplasmática porque desordenan la disposición de las proteínas y fosfolípidos. Esto causa filtración de compuestos celulares, inactivación de enzimas y lisis.

El fenol no es usado a menudo como desinfectante por su olor desagradable, por ser muy irritante y por el residuo que queda luego de tratar las superficies.

Los derivados del fenol más utilizados son el hexaclorofeno (compuesto difenílico) y los cresoles (alquil fenoles). Estos son muy efectivos a bajas concentraciones contra formas vegetativas de bacterias. No son efectivos contra esporas.

 

Oxido de Etileno

Es un agente alquilante que se une a compuestos con hidrógenos lábiles como los que tienen grupos carboxilos, amino, sulfhidrilos, hidroxilos, etc.

Es utilizado en la esterilización gaseosa, generalmente en la industria farmacéutica. Sirve para esterilizar material termosensibles como el descartable y plástico, equipos electrónicos, bombas cardiorrespiratorias, etc. Es muy peligroso por ser altamente inflamable y explosivo, y además cancerigeno.

 

 

Esterilización > Filtración

Se usan membranas filtrantes con poros de un tamaño determinado. El tamaño del poro dependerá del uso al que se va a someter la muestra. Hay que tener en cuenta que los filtros que se utilizan generalmente en los laboratorios no retienen virus ni micoplasmas, estos últimos están en el límite de separación según el diámetro de poro que se utilice.

Existen tres tipos básicos de filtros:

·         Filtros profundos o Filtros de profundidad: consisten de un material fibroso o granular prensado, plegado, activado, o pegado dentro de los canales de flujo. En este tipo de filtros la retención de las partículas se produce por una combinación de absorción y de retención mecánica en la matriz.

·         Membranas filtrantes: tienen una estructura continua, y la retención se debe principalmente al tamaño de la partícula. Partículas más pequeñas al tamaño del poro quedan retenidas en la matriz del filtro debido a efectos electrostáticos.

·         Filtros de huella de nucleación (Nucleoporo): son películas muy delgadas de policarbonato que son perforadas por un tratamiento conjunto con radiación y sustancias químicas. Son filtros con orificios muy regulares que atraviesan la membrana verticalmente. Funcionan como tamices, evitando el paso de toda partícula con un tamaño mayor al del poro.

La filtración se utiliza para emulsiones oleosas o soluciones termolábiles. Su usa para esterilizar aceites, algunos tipos de pomadas, soluciones oftálmicas, soluciones intravenosas, drogas diagnósticas, radiofármacos, medios para cultivos celulares, y soluciones de antibióticos y vitaminas.

 

Esterilización > Controles en esterilización

 

Controles de Esterilización

Controles fisico-químicos

Monitorean el proceso de esterilización

Controles biológicos

Controles de
Esterilidad

Transferencia a medios de cultivo

Monitorean el material esterilizado

Test de promoción del crecimiento

Test de bacteriostásis

Filtración por membranas

 

Controles de Esterilización

Son controles que se realizan sobre el método de esterilización. Monitorean o controlan si el proceso de esterilización funciona correctamente.

Controles Biológicos
Utiliza indicadores biológicos como controles del proceso de esterilización. Estos indicadores son preparaciones estandarizadas de microorganismos relativamente resistentes al método de esterilización que se emplea. Los indicadores se procesan en forma conjunta con el material a esterilizar y el número de microorganismos presentes en el indicador es mayor que el que se encuentra en el material.

Una vez concluido el proceso de esterilización los indicadores son inoculados en medios de cultivo adecuados e incubados durante un determinado período de tiempo. Si el proceso de esterilización fue correctamente empleado y funciona bien no debe observarse desarrollo del indicador incubado.

 

Controles fisicoquímicos

  • Termocuplas: son métodos directos que registran la temperatura a la que se desarrolla la esterilización.
  • Sustancias de punto de fusión conocido: se utilizan en autoclaves generalmente, son sustancias con un punto de fusión similar al de la temperatura de esterilización del proceso. Estas sustancias están mezcladas con un colorante y al fundir indican si se alcanzó la temperatura óptima de esterilización y el tiempo que se mantuvo.

 

Controles de Esterilidad

Permite controlar en forma probabilística si el material quedó completamente esterilizado pues se testea un porcentaje representativo de todo el material.

Transferencia Directa a Medios de Cultivo
Se transfiere una parte de la muestra a medios de cultivos apropiados que permitan el crecimiento de cualquier contaminante.

  • Tioglicolato para anaerobios y aerobios (37°C)
  • Tripticasa-Soja para aerobios (25°C)

Las muestras representativas se incuban en estos medios durante un período de 14 días, al cabo del cual no se debe observar ningún tipo de crecimiento.

Puede ocurrir que la muestra no se encuentre estéril pero que no se produzca crecimiento durante la incubación por algún motivo inherente al medio o a la muestra, por ejemplo presencia de algún inhibidor, etc.

Test de Promoción del Crecimiento
Es un testigo del control de esterilidad. Son testigos que se utilizan para los medios de crecimiento del control ya que estos medios tienen capacidad de promover el crecimiento. Para estos testigos se utilizan microorganismos con exigencias nutricionales. Los medios deben ser inoculados con un bajo número de microorganismos, se incuban durante 7 días, al cabo de los que se debe observar un abundante crecimiento.

Test de Bacteriostasis
Es un control que se realiza para determinar si la muestra supuestamente estéril no posee propiedades bacteriostáticas. De esta forma se previenen falsos negativos pues no se produce crecimiento habiendo en la muestra microorganismos viables. Para este test se toman los medios de cultivo con microorganismos de ensayo y se siembran en las muestras a testear. Se incuban durante 7 días. Si se produce crecimiento esto indica que el material no contenía inhibidores.

 

Filtración por Membranas
Se utiliza para determinar la esterilidad de medios de cultivo, soluciones de antibióticos, etc.

Se filtran los medios y se procesa el filtro como en un control de esterilidad para determinar si hay microorganismos presentes.

 

 

Esterilización > Concepto estadístico

Cuando una población bacteriana es sometida a un proceso de esterilización que le provoca la pérdida de la viabilidad, se observa una disminución progresiva en el número de microorganismos sobrevivientes en función del tiempo de exposición al agente esterilizante. La muerte microbiana sigue un comportamiento de tipo exponencial, por lo que se hace asintótico y nunca se llega a un número de microorganismos igual a cero.

N = N0 . e - Kt

Donde N es el número de microorganismos viables, N0 es el número de microorganismos viables iniciales, k es la tasa de muerte (min-1) y t es el tiempo de exposición al agente. El coeficiente k es función de las condiciones de esterilización (temperatura, tenor de humedad, concentración del agente químico) y de la resistencia del microorganismo al proceso de esterilización. Si esta ecuación se transforma a base 10 resulta:

N = N0 . 10 - t / D

En donde D (min) se denomina Tiempo de reducción decimal, esto es el tiempo requerido para reducir la población microbiana un 90% o un orden de magnitud. El valor de D se deduce cuando t=D y por lo tanto N=0.1 N0. Comparando las ecuaciones anteriores se llega a que:

D = ln 10 / K = 2.303 / K

Esto significa que D está inversamente relacionado con k. Entonces, menores valores de D significan una mayor tasa de muerte o una muerte más rápida.

Graficando el logarítmo del número de microorganismos sobrevivientes en función del tiempo de exposición a un determinado agente esterilizante se obtiene una recta. La pendiente está dada por -1/D y la ordenada al origen es log N0. Por lo explicado anteriormente, la pendiente de la recta está determinada por las condiciones de esterilización y de la resistencia del microorganismo.

 

 

Cuando el log del número de sobrevivientes es menor a cero se habla de probabilidad de sobrevivencia. Por lo tanto cuando el valor de la probabilidad sea -1 significa que hay 0.1 microorganismos viables por unidad, o correctamente expresado una unidad contaminada por cada 10 unidades idénticas procesadas.

Un producto se considera estéril cuando la probabilidad de encontrar unidades contaminadas es menor o igual a 10-6, esto es una unidad contaminada cada millón de unidades idénticas procesadas.

A mayor número de microorganismos y/o resistencia de la población se necesitará mayor tiempo de esterilización, o lo que es lo mismo mayor tiempo para alcanzar la probabilidad de sobrevivencia.

Durante el proceso de esterilización por calor debe tenerse en cuenta que el tiempo de esterilización comienza cuando se ha alcanzado la temperatura óptima en el interior del aparato (autoclave o estufa) y que generalmente el contenido de un autoclave puede requerir tiempos más largos para alcanzar la temperatura de esterilización.

 

BIBLIOGRAFÍA

 

 http://www.microbiologia.com.ar/