Medida del crecimiento

El crecimiento de una población bacteriana puede ser entendido desde diferentes perspectivas y de acuerdo a éstas se puede llegar a determinar la medida del crecimiento mediante diversas metodologías.

Para algunos, el crecimiento es la capacidad para multiplicarse que tienen las células individuales, esto es iniciar y completar una división celular. De esta forma, se considera a los microorganismos como partículas discretas y el crecimiento es entendido como un aumento en el número total de partículas bacterianas. Existen dos formas para determinar el número total de microorganismos en una muestra:

  • Recuento microscópico de partículas
  • Recuento electrónico de partículas

Para otros, el crecimiento implica el aumento de los microorganismos capaces de formar colonias debido a que sólo se tiene en cuenta el número de microorganismos viables, esto es capaces de crecer indefinidamente. Las determinaciones que se utilizan son:

  • Recuento de colonias
  • Método del número más probable

Para los fisiólogos bacterianos, bioquímicos y biólogos moleculares una medida del crecimiento es el incremento de biomasa. Para ellos, la síntesis macromolecular y un incremento en la capacidad para la síntesis de los componentes celulares es una medida del crecimiento. Para este grupo la división celular es un proceso esencial pero menor que rara vez limita el crecimiento, ya que lo que limita el crecimiento es la capacidad del sistema enzimático para utilizar los recursos del medio y formar biomasa.

  • Determinación de peso húmedo
  • Determinación de peso seco
  • Determinación de nitrógeno total
  • Determinación química de un ácido nucleico

Un último grupo entiende al crecimiento sobre la base de la influencia que ejercen los microorganismos en los cambios químicos de su entorno como consecuencia del incremento de la biomasa.

 

Recuentos Directos

Recuento microscópico: Es una técnica común, rápida y barata que utiliza un equipamiento fácilmente disponible en un laboratorio de microbiología. Para estos recuentos se utilizan generalmente cámaras de recuentos, aunque también pueden realizarse a partir de muestras filtradas en membranas y transparentadas o teñidas con colorantes fluorescentes (Naranja de acridina).

La mayor dificultad del recuento en cámara es obtener reproducibilidad en el llenado de la cámara con líquido. Otra dificultad es la adsorción de las células en las superficies del vidrio, incluyendo pipetas. Esta adsorción es crítica en el proceso de dilución de la muestra y se minimiza al realizar las diluciones en medios de alta fuerza iónica (solución fisiológica o medios mínimos sin fuente de carbono).

Las cámaras más utilizadas son las de Hawksley y la de Petroff-Hausser. La primera tiene la ventaja que puede ser utilizada con objetivos de inmersión, aunque la mayoría de los recuentos se realizan con objetivos secos. Una de las mayores ventajas del recuento microscópico es brindar información adicional sobre el tamaño y la morfología de los objetos contados.


Camara de recuento de Petroff-Hausser

Tipo de cuadro

Area
[cm
2]

Volumen
[ml]

Factor
[1/Volumen]

Cuadrado total

1.00 x 10-2

2.00 x 10-5

5.00 x 104

Cuadrado grande

4.00 x 10-4

8.00 x 10-7

1.25 x 106

Cuadrado pequeño

2.50 x 10-5

5.00 x 10-8

2.00 x 107



 

  • 1/Dilución: Inversa de la dilución utilizada para llenar la cámara de recuento.
  • Número de cuadrados contados: Cantidad de cuadrados de la cámara que se utilizaron para contar un el número de bacterias.
  • Volumen del cuadrado: Volumen de cada cuadrado de la cámara. Depende del tipo de cuadrado en donde se realizó el recuento. Por ejemplo, cada cuadrado pequeño tiene un volumen de 5 x 10-8 ml (50 µm x 50 µm x 20 µm = 5 x 104 µm3 = 5 x 10-8 ml)

 

Recuento electronico: Los contadores electrónicos permiten realizar recuentos de bacterias, levaduras no filamentosas y protozoarios, pero no de hongos y microorganismos filamentosos o miceliares.

Estos instrumentos constan básicamente de dos compartimientos comunicados a través de un pequeño conducto. En ambos compartimientos hay electrodos que miden la resistencia eléctrica del sistema, y como el orificio del conducto es muy pequeño y su resistencia es muy alta, la resistencia eléctrica de cada compartimiento es independiente. El principio de funcionamiento de estos instrumentos es el que se explica a continuación. Un volumen fijo de una suspensión bacteriana es forzada a pasar desde un compartimiento al otro a través del pequeño conducto, en un muy breve intervalo de tiempo. Cuando un microorganismo pasa al nuevo compartimiento, la resistencia de éste se incrementa debido a que la conductividad de la célula es menor que la del medio. Estos cambios en la resistencia son convertidos en pulsos o voltaje y contados.

Este tipo de recuento presenta algunos inconvenientes. Ciertas bacterias muy pequeñas producen cambios en la resistencia que son comparables al "ruido" generado por la turbulencia que se desarrolla al pasar el fluido por el orificio. No pueden medirse células que formen filamentos o agregados o soluciones muy concentradas de microorganismos, debido a que el pasaje de más de una célula en un breve período de tiempo va a ser tomado como una célula más grande. Es común la obstrucción del orificio por microorganismos muy grandes.

 

Medida de la Biomasa

La medida de la masa de los constituyentes de la célula bacteriana es utilizada frecuentemente como base para la medida de una actividad metabólica, o de un constituyente metabólico o químico.

Algunos de los métodos para cuantificar la biomasa son obvios y confiables, pero pueden volverse complicados si se busca la exactitud.

Peso húmedo: Se obtiene a partir de una muestra en suspensión que es pesada luego de la separación de las células por filtración o centrifugación. Es una técnica útil para grandes volúmenes de muestra.

La principal desventaja es que el diluyente queda atrapado en el espacio intercelular y contribuye al peso total de la masa. La cantidad de líquido retenida puede ser importante, por ejemplo, un pellet de células bacterianas muy empaquetadas puede contener un espacio intercelular que aporta entre el 5-30% del peso, de acuerdo a la forma y deformación celular. Para corregir el peso húmedo se determina la cantidad de líquido que queda retenida en el espacio intercelular luego de una centrifugación, para ello se utilizan soluciones de polímeros no iónicos (como el Dextran) que pueden ingresar en el espacio intercelular pero no pueden atravesar las paredes bacterianas.

Peso seco: El peso seco (contenido de sólidos) de las células bacterianas que se encuentran en una suspensión se obtiene por el secado de un volumen en un horno a 105°C hasta peso constante. Esta técnica es útil para grandes volúmenes de muestra, debido a que diferencias del orden de los miligramos representan el peso de un gran número de bacterias.

La desventaja de este método es que componentes volátiles de la célula pueden perderse por el secado y puede existir alguna degradación. También la muestra seca puede recobrar humedad durante el pesado, principalmente si el ambiente tiene una humedad relativa alta.

Determinación de ácidos nucleicos: Es una técnica que permite determinar indirectamente la masa de una población bacteriana. Se determina la cantidad existente de un determinado ácido nucleico (generalmente DNA) y a partir de este dato se estima la masa de la población.

Determinación de nitrógeno: Es una técnica que permite determinar indirectamente la masa de una población bacteriana. Existen distintas técnicas para determinar la cantidad de nitrógeno que contiene una muestra con relación al compuesto que se quiera determinar. Puede analizarse el nitrógeno no proteico mediante el NO2-, NO3-, NH4+, el nitrógeno proteico mediante absorción en UV, Reacción de Biuret, Reacción de Lowry, o el nitrógeno total mediante la Digestión de Kjeldahl.

Incorporación de precursores radiactivos: Es una técnica que permite determinar indirectamente la masa de una población bacteriana. En esta técnica se adiciona al medio un compuesto marcado radiactivamente que puede ser incorporado a la célula, y luego se determina la cantidad de marca incorporada por toda la población.

 

Dispersión de la Luz

Cuando un haz de luz paralelo (colimado) golpea una partícula en suspensión, parte de la luz es reflejada, parte es diseminada, parte es absorbida y parte es transmitida. La nefelometría mide la luz dispersada por una solución de partículas. La turbidimetría mide la luz dispersada como un decrecimiento de la luz transmitida a través de la solución. Con relación a la longitud de onda y al tamaño de la partícula pueden existir tres tipos de dispersión.

Los métodos de dispersión de la luz son las técnicas más utilizadas para monitorear el crecimiento de los cultivos bacterianos. Son muy útiles y poderosos pero pueden llevar a resultados erróneos. Principalmente, dan información sobre el peso seco (contenido macromolecular).

Turbidimetría: La turbidimetría mide la reducción de la transmisión de luz debido a partículas de una suspensión y cuantifica la luz residual transmitida.

Estudios teóricos y experimentales han mostrado que soluciones diluidas de diferentes tipos de bacterias, independientemente del tamaño celular, tienen casi la misma absorbancia por unidad de concentración de peso seco. Esto quiere decir que, en soluciones diluidas, la absorbancia es directamente proporcional al peso seco, independientemente del tamaño celular del microorganismo. Sin embargo, se encuentran absorbancias muy diferentes por partícula o por UFC (Unidad Formadora de Colonia) cuando los tamaños de las células bacterianas son diferentes. Por esta razón, para estimar el número de microorganismos totales o el número de microorganismos viables de una suspensión bacteriana debe realizarse una "curva de calibración" con cada tipo de microorganismo, sólo de esta forma es posible relacionar Absorbancia (Densidad Óptica) con el número de microorganismos totales o con UFC.

 



Absorbancia en función del Peso Seco


Absorbancia = K x Peso Seco

K: constante que varía con la longitud de onda utilizada y representa la inversa del peso seco del microorganismo que produce un aumento de 10 veces en el valor de la absorbancia (1/W0).

Peso seco: Concentración celular bacteriana expresada en unidades de peso seco (µg/ml-mg/ml).

La relación directa entre la absorbancia y el peso seco sólo se aplica para suspensiones diluidas de bacterias. Estas suspensiones no deben tener una absorbancia mayor a 0.3, ya que valores mayores producen desviaciones de la ley de Beer. Sin embargo, el inconveniente de utilizar suspensiones diluidas puede involucrar un mayor error de pipeteo y menor sensibilidad por el bajo nivel de absorción.



Absorbancia en función del Peso Seco




Absorbancia en función del Número de Microorganismos Totales

 

En estos gráficos se puede apreciar que suspensiones diluidas de dos microorganismos diferentes con igual peso seco tienen la misma absorbancia, mientras que para el mismo número de microorganismos totales la absorbancia de cada suspensión es distinta.

 

 

Bibliografía:

http://www.microbiologia.com.ar/bacteriologia/fisiologia.php?Mostrar=medida

http://www.unavarra.es/genmic/curso%20microbiologia%20general/12-metodos%20de%20recuento.htm