IDENTIFICACIÓN DE UNA CEPA BACTERIANA


 

Existen diferentes sistemas de clasificación de bacterias, pero el más comúnmente utilizado es el Bergey's Manual of Determinative Bacteriology.

La identificación de una bacteria es su asignación a un taxón según una clasificación dada. Consiste en la determinación de las características fenotípicas y/o genotípicas y la comparación de estas características con los diferentes taxones de la clasificación considerada.  Las características a determinar y su número depende principalmente del tipo de bacteria y del fin que se persigue en la identificación.

 A continuación se propone un esquema de trabajo para la identificación de una cepa bacteriana desde el punto de vista bioquímico (Biotipo):

 1) Obtener un cultivo puro

 2) Examen microscópico de células vivas y de frotis teñido por coloración Gram. Se determina así la forma y el Gram del microorganismo en estudio. También es importante determinar la agrupación y la presencia de esporas y otras características morfológicas de interés.

 3) Determinar las características nutricionales (en general se desprenden de los métodos empleados en el aislamiento y cultivo anteriores); fotoautótrofos, fotoheterótrofos, quimioautótrofos, quimioheterótrofos.

 4) Realización de pruebas primarias:  En la siguiente tabla, modificada del Cowan & Steel's Manual of Identification of medical bacteria, se utilizan un grupo de pruebas, denominadas pruebas primarias, con las cuales se puede determinar el género, grupo de géneros o en algún caso familia a la que pertenece un aislamiento. Las pruebas primarias son:  Gram, morfología, catalasa, oxidasa, OF, fermentación de glucosa, esporas, crecimiento en aerobiosis y anaerobiosisy movilidad.

 5) Realización de pruebas secundarias y terciarias a efectos de llegar a especie. Estas dependerán del género o familia determinado. (ej: producción de pigmentos, producción de indol a partir de triptofano, producción de coagulasa, de fenilalanina deaminasa, etc.)

 Serotipo

 A los efectos de realizar identificaciones más rápidas, o cuando las pruebas bioquímicas no son concluyentes, se recurre al uso de antisueros específicos.
 Los antígenos bacterianos pueden ser capsulares, somáticos (O) que corresponden al lipopolisacárido de la pared de los Gram negativos, flagelares (H), y los antisueros se identifican con esas letras y el número o letra del antígeno correspondiente.
 En una primera identificación se usan sueros polivalentes y para la caracterización serológica se usan sueros monovalentes dentro de cada tipo de antígeno.
 Existen en el comercio antisueros para caracterización de: Salmonella, Shigella, E.coli, Haemophilus, etc.
 También se pueden utilizar métodos de cromatografía gaseosa para identificar productos metabólicos, en particular para la identificación de bacterias anaerobias no esporuladas como: Bacteroides, Fusobacterium, etc.
 

Se puede expresar el nombre de una cepa de la siguiente manera:

                   
 Yersinia entercolítica             03 
  género    especie     biotipo  serotipo 
 

ENSAYOS BIOQUIMICOS

La identificación de un aislamiento bacteriano puede realizarse utilizando diferentes combinaciones de características y diferentes criterios en la evaluación de similitudes.

Los ensayos bioquímicos tradicionalmente utilizados, llamadas pruebas bioquímicas convencionales, generalmente determinan la actividad de una vía metabólica (conjunto de reacciones químicas) a partir de un sustrato que se incorpora en un medio de cultivo y que la bacteria al crecer transforma o no.

Existen diferentes sistemas que facilitan la realización de tales ensayos, porque proponen el mejor conjunto de pruebas bioquímicas para la identificación de un grupo bacteriano, porque simplifican la interpretación de un resultado utilizando un valor numérico, porque proveen los reactivos listos para su uso o porque son totalmente automatizables.

 Las pruebas o ensayos bioquímicos, son pruebas simples que se han desarrollado para demostrar en forma clara una determinada característica bioquímica como presencia o ausencia de una determinada actividad enzimática, grupo de enzimas o determinada vía metabólica, crecimiento a una determinada temperatura, crecimiento en presencia de inhibidores, etc. No significan de ninguna manera un estudio profundo del metabolismo bacteriano.

 Para llevarlas a cabo, se pueden utilizar diferentes sistemas de trabajo (medio de cultivo, indicador, revelador, etc.) que puede ser diferente aún para el mismo ensayo si se trata de diferentes microorganismos. Por ejemplo se debe suplir con factores de crecimiento el medio de cultivo para estudiar la fermentación de distintos azúcares cuando se sabe que el microorganismo en estudio es exigente.
 A la determinación de la especie se puede llegar según diversos sistemas (manuales de identificación, comerciales, etc.).

 a) Los comerciales utilizan modificaciones de las pruebas bioquímicas convencionales, ya sea sustratos deshidratados, tiras de papel de filtro impregnadas en reactivos o pequeños compartimentos con medios listos para sembrar. En todos los casos se emplean códigos numéricos para la interpretación de resultados.

 Los sistemas comerciales más comúnmente usados son :

* BBL, ENTEROTUBE II  (Becton Dickinson).  Es un sistema para usar en la identificación de Enterobacterias, definida como bastones Gram -, aerobios o anaerobios facultativos, oxidasa (-). Consiste en un tubo de plástico con 12 medios de cultivo contenidos en compartimentos individuales que se inoculan simultáneamente en una etapa y permiten la detección de 15 características bioquímicas.

* OXI/FERM TUBE II, (Becton Dickinson).  Es un sistema listo para usar para la identificación de bastones gram (-), aerobios o anaerobios facultativos, oxidasa (+). Consiste en un tubo de plástico de 12 medios de cultivo que permite la realización simultánea de 14 pruebas bioquímicas.

* API 20 E.  Es un sistema estandarizado para la identificación de Bacterias Gram -. Consiste en una plantilla con microtubos conteniendo medios de cultivo deshidratados que se reconstituyen al agregar una suspensión bacteriana. Permite la realización de 23 pruebas bioquímicas a partir de una única colonia bacteriana.
 

Otros sistemas:

Quintet 3H de Diagnostics Pasteur para Enterobacterias.
API 10S, versión miniaturizada del API 20 E
API Listeria
API NH  (Neisseria - Haemophilus)

Existen también sistemas de identificación comerciales para levaduras:

API 20 C  (Para levaduras del género Candida)
Auxacolor de Diagnostics Pasteur
Fongiscreen 4H de Diagnostics Pasteur (Para identificación de levaduras de interés médico)

 b) En la Cátedra se desarrolló un sistema para la identificación de Enterobacterias que consta de nueve pruebas bioquímicas convencionales (SYS 9E). Este sistema identifica las 23 especies más frecuentemente aisladas de muestras clínicas. Está integrado por las siguientes pruebas: producción de H2S en agar triple azúcar hierro (TSI), fenilialanina deaminasa, producción de indol, descarboxilación de lisina, descarboxilación de ornitina, crecimiento en citrato, fermentación de arabinosa, fermentación de sorbitol y producción de acetoína (VP).

 En esquema, la realización de una prueba bioquímica implica:

 1) Cultivar el microorganismo en un medio que contiene un  determinado sustrato o inhibidor y luego de la incubación visualizar el crecimiento y la degradación de un sustrato, ya sea por viraje de un indicador o por agregado de un reactivo revelador de la presencia del sustrato, o de algún producto de su degradación.

 2) Cultivar el microorganismo en un medio de propagación que contenga el sustrato de una enzima inducible y luego de la incubación demostrar la actividad enzimática.

 En todos los casos se debe tener un cultivo fresco (18-24 hrs. de incubación) en un medio en que el microorganismo se desarrolla en forma óptima, a pH, fuerza iónica, atmósfera y temperatura adecuados.
 Siempre que se prepara un nuevo lote de medio de cultivo para una prueba, deben llevarse a cabo los correspondientes controles de calidad, sembrando en dicho medio una cepa positiva y otra negativa para ese test.

 Si bien existen una gran variedad de pruebas bioquímicas empleadas con fines de identificación, se enumerarán a continuación solo las que se utilizan más frecuentemente, agrupadas según el tipo de ensayo y se denominan según su nombre corriente.
 

 1) Enzimas vinculadas con la respiración

    a) oxidasa
    b) catalasa

 2) Descomposición de azúcares simples, ácidos orgánicos y  otros

    2.1) Requerimientos de oxígeno

 OF (óxido-fermentación)
 Crecimiento en caldo tioglicolato

    2.2) Producción de ácido, o ácido y gas

 Fermentación de carbohidratos

    2.3) Detección de enzimas y vías metabólicas

a) RM-VP (rojo de metilo - Voges Proskauer)
b) Gluconato
c) O.N.P.G. (orto nitro ß-D-galactopiranósico)
d) Esculina
e) Hipurato

 3) Fuente única de carbono

a) citrato
b) malonato
c) hipurato para coliformes

 4) Utilización de compuestos nitrogenados

    4.1) Reducción de nitrato

  a) asimilación
  b) denitrificación

    4.2) Descomposición de carbohidratos aminoácidos y otros

a) indol
b) H2S
c) Fenilalanina
d) Lisina, arginina, ornitina
e) Urea

 5) Ensayos combinados

a) TSI (Triple Azúcar Hierro)
b) LIA (Agar Hierro Lisina)
c) Bilis esculina

 6) Detección de exoenzimas

 a) lecitinasa
 b) proteasas, coagulasa
 c) amilasas
 d) celulasas
 e) desoxirribonucleasas
 f) acción de microorganismos sobre la sangre (hemolisinas)

 7) Misceláneos

     a) KCN
     b) Bilis
     c) producción de pigmentos

 8) Test de crecimiento o inhibición

    a) Temperatura
    b) NaCl 
    c) Antibióticos

 

 TABLA MODIFICADA DE COWAN´S & STEEL PARA IDENTIFICACION DE BATERIAS HETERÓTROFAS

 

tinción gram
(cultivo fresco)

+

+

+

+

+

+

+

+

forma

coco

coco

coco

coco

bastón

bastón

bastón

bastón

bastón

bastón

bastón

bastón

coco

agrupación

racimos

racimos

cadenas

tetradas

 

 

 

 

 

 

 

 

pares

crecimiento 
aerobio

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

crecimiento 
anaerobio

+

+

+

+

+

+

+

+

esporas

+

+

+

movilidad 

+ o –

+ o –

+ o –

+ o –

+ o  –

+ o -

+

catalase 

+

+

+

+

+

+

+

+

+

oxidase 

 

 

 

 

 

 

 

 

+

+

+

+

fermentación de
glucosa a acido 
o a acido+gas

+

+

+

+

+ (o –)

+

+

+

O/F 

 

 

 

 

 

 

 

 

O

F

F

O

Micrococcus

X

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Staphylococcus

 

X

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Streptococcus

 

 

X

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Lactococcus

 

 

X

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Enterococcus

 

 

X

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Leuconostoc

 

 

X

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Pediococcus

 

 

X

X

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Aerococcus

 

 

 

X

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Lactobacillus

 

 

 

 

X

 

 

 

 

 

 

 

 

Clostridium

 

 

 

 

 

X

 

 

 

 

 

 

 

Bacillus

 

 

 

 

 

 

X

X

 

 

 

 

 

Alcaligenes

 

 

 

 

 

 

 

 

X

 

 

 

 

Pseudomonas

 

 

 

 

 

 

 

 

 

X

 

 

 

 Enterobacterias

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

X

 

 

Aeromonas

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

X

 

Chromobacterium

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

X

 

Neisseria

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

X


 Bibliografía:

http://bilbo.edu.uy/~microbio/identific02.html