REACCIÓN SEROLÓGICA DE AGLUTINACIÓN

 

Julia Mas



En las técnicas de grupos sanguíneos eritrocitarios las reacciones más importantes son las de aglutinación. Los antígenos situados en la membrana de los hematíes reaccionan con los anticuerpos y el resultado de la reacción es la formación de grumos de hematíes o aglutinados. Las determinaciones de antígenos hemáticos y el estudio de anticuerpos en sueros se basan principalmente en la aglutinación de los hematíes, aunque en ocasiones la unión antígeno/anticuerpo que activa la vía clásica del sistema del complemento puede ser detectada por una hemólisis «in vitro». Los anticuerpos de grupo sanguíneo esencialmente hemolíticos son: anti-A, anti-B, anti-Lea, anti-Vel y anti-PP1p .

La reacción hemolitica «in vitro» debida a los anticuerpos de grupo sanguíneo se produce con poca frecuencia ya que la secuencia de la activación del complemento se interrumpe a partir del componente C3-

Un factor muy importante es el tipo de inmunoglobulina a que pertenecen los anticuerpos reaccionantes. Si los anticuerpos son del tipo IgM la aglutinación se produce directamente. Por su tamaño molecular y la distribución de los lugares de reacción con los antígenos, pueden unirse fácilmente con varios hematíes y producir su aglutinación (Figs. 10 y 11).

Figura 10. Esquema de la molécula IgM

Figura 11. Hematíes aglutinadas por una molécula de anticuerpo de tipo Ig]M

 

La sensibilización de hematíes por anticuerpos de tipo IgG no puede producir aglutinación. La molécula de IgG es demasiado, pequeña para unirse a más de un hematíe a no ser que se introduzca algún artificio que ya indicaremos (Figs. 12 y 13).

Figura 12. Esquema de la molécula IgG                       

Figura 13. Hematíes sensibilizados por moléculas de IgG

 

La distancia que han de salvar los anticuerpos para producir aglutinación es la que guardan entre sí los hematíes en suspensión en su propio suero o plasma o en un medio salino isotónico, distancia que viene impuesta por las fuerzas de repulsión existentes entre los hematíes. La teoría más ampliamente aceptada para explicar este hecho es la del potencial Zeta.

La superficie de los hematíes tiene cargas eléctricas negativas debidas a los carboxilos del ácido siálico (NANA) de la membrana. Si los hematíes están en suspensión en un medio que contiene iones libres, los cationes forman una envoltura de cargas positivas alrededor de aquellos convirtiéndolos en partículas cargadas de electricidad del mismos signo que experimentan una fuerza de repulsión entre ellas. Esta fuerza de repulsión se denomina potencial Zeta y puede expresarse mediante la fórmula siguiente (Fig. 14):

POTENCIAL Z

Figura 14. Cálculo del Potencial Zeta
σ = carga eléctrica de los hematíes
D = constante dieléctrica del medio
y = fuerza iónica del medio

 

El potencial Zeta puede ser disminuido por el aumento de la constante dieléctrica (D) mediante la adición de sustancias macromoleculares (albúmina bovina, etc.); por la disminución de las cargas negativas de los hematíes (σ ) mediante la acción de enzimas proteolíticas. Es decir, podremos lograr la disminución de la distancia entre los hematíes favoreciendo la sensibilización y aglutinación de los mismos. En la Tabla IV se dan como ejemplo diversos valores del potencial Zeta y su influencia sobre la aglutinabilidad de los hematíes.

- 23 mV

 

 

No hay aglutinación

 

 

- 18 mV

 

 

Crítico para IgM

 

 

-16 mV

 

 

Solución NaCI 0,15

 

 

- 10 mV

 

 

Crítico para IgG

 

 

- 7 mV

 

 

Aglutinación no específica

 

 

 Tabla IV Aglutinabilidad de los hematíes en función del potencial Z


La base molecular de la unión de los antígenos con los anticuerpos la constituyen múltiples atracciones intermoleculares no covalentes, reversibles:

Uniones hidrófobas con exclusión de moléculas de agua en las zonas de interacción.

Puentes de hidrógeno (O-H-0, N-H-N, 0-H-N).

Fuerzas de Van der Waals, resultantes de la interacción entre nubes electrónicas y uniones hidrófobas. Son fuerzas débiles pero la suma de las mismas puede ser importante en las uniones antígeno/anticuerpo.Fuerzas electrostáticas procedentes de la atracción entre aminoácidos  de cargas opuestas.

La reacción serológica de aglutinación de los hematíes que constituye el punto final de técnicas en las que intervienen antígenos hemáticos y anticuerpos de grupo sanguíneo, está influenciada por diversos, factores que deben tenerse en cuenta para obtener los mejores resultados en el laboratorio y que a continuación se exponen.



REACCIÓN SEROLÓGICA DE AGLUTINACIÓN, FACTORES QUE INFLUYEN SOBRE DOS FASES

Fase de sensibilización

Unión de los anticuerpos con los antígenos de la membrana del hematíe.
Temperatura óptima para cada sistema antígeno/anticuerpo.
pH entre 6,5 y 7,6.
Concentración relativa del antígeno y del anticuerpo (Fig. 15).
Fuerza iónica del medio.
Tiempo de incubación (Fig. 16).

Figura 15.
Reacción de aglutinación según la concentración de antígeno y anticuerpo

 

 

Figura 16.
Formación del complejo antígeno-anticuerpo en función del tiempo



Fase de aglutinación

Se produce cuando los hematíes están lo bastante próximos para que una molécula de anticuerpo pueda hacer de puente entre células adyacentes.
Potencial iónico del medio. Potencial Zeta.
Temperatura.
Densidad del antígeno.
Agrupación y movilidad de los antígenos.

Características del anticuerpo (clase de inmunoglobulina y su modificación química (Fig. 17).

Figura 17. Tratamiento químico de una molécula de IgG.
Mediante reducción de los puentes disulfuro que unen las dos cadenas H se consigue que la molécula de IgG tenga mayor envergadura y pueda cubrir más fácilmente la distancia que existe entre hematíes adyacentes

 

Para potenciar las reacciones de aglutinación y facilitar así la lectura e interpretación de los resultados, se emplean diversos métodos, que pueden consistir simplemente en una centrífugación, controlada en cuanto a tiempo y velocidad, y/o en la adición de soluciones de enzimas proteolíticas, soluciones coloidales de compuestos macromoleculares, etc., y en la aplicación de la técnica de antiglobulina. La centrifugación logra la formación de grumos visibles en el momento de efectuar las lecturas y la adición de medios macromoleculares, de enzimas proteolíticas, y el uso de antiglobulina permiten detectar la sensibilización de los hematíes por anticuerpos de tipo IgG, que generalmente no producen aglutinación.

 

LA AUTOMATIZACIÓN DEL PROCESO EN MICROPLACA

 

Elena Franco

Las técnicas en microplaca empezaron a realizarse de forma exclusivamente manual, por las ventajas que ya se han detallado anteriormente (ahorro de tiempo de técnico, rapidez, ahorro de reactivo y poco utillaje preciso). Dependiendo del volumen de trabajo y de las posibilidades de los laboratorios, los procesos pueden ir automatizándose de forma progresiva.

Desde hace ya unos años la automatización en el laboratorio es una realidad.

El Banco de Sangre, aunque algo más tardíamente también se ha ido automatizando, iniciándose este proceso por las técnicas consideradas más engorrosas; que duda cabe que una de ellas es la determinación del grupo ABO.

Para todas las técnicas las muestras problema y reactivos pueden ser dispensados por medio de pipeteadores-muestreadores automáticos, programando mediante ordenador la localización que queramos dar a cada muestra y reactivo en la microplaca. De forma igualmente automática se preparan las suspensiones de hematíes. Los pipeteadores automáticos son versátiles y programables para realizar distintas funciones tales como diluir, distribuir, dispensar reactivos, etc.

La lectura también puede ser automatizada. Para las reacciones de hemaglutinación se utiliza una técnica iotométrica. Disponemos de distintos tipos de lectores en el mercado. Unos efectúan una lectura del pocillo y varias periféricas; otros, realizan una lectura en forma de barrido de todo el pocillo. La interpretación del resultado depende de la gráfica del conjunto de lecturas efectuadas

Para la correcta interpretación de resultados de forma automática, es más crítico que nunca conseguir un buen patrón de aglutinación. Una aglutinación débil, pero perceptible a simple vista, puede no ser interpretada por el lector. Por esta razón el conseguir los mejores aglutinados mediante el uso de antisueros adecuados, de las suspensiones de hematíes correctas y de una adecuada agitación final de la microplaca, es fundamental.

Gracias al uso de etiquetas con código de barras podemos conseguir una correcta identificación de muestra y resultado. Estos resultados pueden transferirse directamente al ordenador central; de esta forma, se archivan grandes volúmenes de información sin posible error al transcribir los datos, hecho éste de gran importancia en transfusión.

El usuario tiene gran flexibilidad a la hora de diseñar el procedimiento de ensayo a seguir y es libre para elegir los reactivos a emplear.

La automatización de todo el proceso descrito puede ser modular, adaptándose así a las disponibilidades de Banco de Sangre con distintos volúmenes de procesamiento. Es evidente que la relación costo-beneficio, con aplicación de tecnología de alto costo, se justifica para el procesamiento de grandes volúmenes. Sin embargo, la adopción de un sistema modular puede ser rentabilizado para diferentes situaciones intermedias.

A la hora de realizar un estudio de costo de la automatización del proceso es importante destacar el ahorro de tiempo de técnico y la seguridad que proporciona al minimizar errores técnicos y de transcripción de datos.

A continuación se detalla la realización de las técnicas, tanto de forma manual como automatizada.

 

DETERMINACIÓN DEL GRUPO Y Rh EN MICROPLACA

 


Elena Franco
Matilde Sedeño

MATERIAL

Técnica automática

-    Muestra problema extraída en tubo con anticoagulante (EDTA-K).
-
    Antisueros: anti-A, anti-B, anti-AB, anti-D. Control anti-D, en dilución óptima de trabajo.
-
    Albúmina al 3 %, para la dilución de los antisueros.
-
    Solución salina para la dilución de los hematíes problema. También puede utilizarse bromelina al 0,1% en salina. Los resultados son los mismos.
-
    Hematíes A, B y 0, suspendidos al 2-4%, para la determinación del grupo sérico.
-
    Microplacas con fondo en U de 96 pocillos.
-
    Pipetas de 0 a 10 lambdas.
-
    Pipetas de 1 0 a 1 00 lambdas.
-
    Pipetas repetidoras de 10 a 50 lambdas.



Técnica automática

 

Además de las muestras y reactivos anteriormente descritos:

-    Pipeteador-muestreador automático
-
    Lector de microplacas y programa que interprete los resultados
-
    Etiquetas con código de barras en las muestras problema



TECNICA MANUAL

 

Una vez centrifugados los tubos de muestra, proceder como sigue:



Grupo hemático

Dispensar 30 lambdas de solución salina ayudados de una repetidora, en los pocillos destinados a la determinación del grupo hemático; pocillos A, B, C, D, E (Fig. 1 S).

Añadir 1 lambda de concentrado de hematíes problema en cada uno de estos pocillos, de forma que en cada columna se estudie una muestra.

Con una pipeta repetidora añadir 30 lambdas del antisuero correspondiente (anti-A en la fíla A, anti-B en la fila B, anti-AB en la fila C, anti-D en la fila D y control anti-D en la fila E).



Grupo sérico

Dispensar 50 lambdas de plasma o suero de la muestra, en los pocillos destinados a la determinación del grupo sérico, pocillos F-, G, H (Fig. 18).

Figura 18 Columnas 1 a 12: muestras. Filas A, B, C, D, E: suspensiones de hematíes. Filas F,G, H. suero o plasma.


Con una pipeta repetidora añadir 30 lambdas de suspensión de hematíes A en la fila F, 30 lambdas de suspensión de hematíes B en la fila G y 30 lambdas de suspensión de hematíes 0 en la fila H.



TÉCNICA AUTOMÁTICA

Colocar el rack de muestras, la solución salina, los antisueros y las mícroplacas en el pipeteador automático.

Proceder a la dispensación de las placas con el programa adecuado (ABO, Rh).

Una vez dispensadas las muestras de hematíes para grupo hemático y suero para grupo sérico, seguir los pasos de centrifugado, etc. como en la forma manual.

Centrifugar a 400 g durante 30 segundos.

Agitar hasta conseguir la resuspensíón del botón de hematíes de los controles (control anti-D y hematíes 0).

Proceder a la lectura de las placas, con lectores automáticos que puedan pasar la información al ordenador central.

En el caso de que la lectura se haga visual, el procedimiento sería semiautomático (Fig. 19).

Figura 19. Ejemplo de resultados de la determinación ABO (prueba hemática y sérica) y Rh en microplaca

 Bibliografía:

                                        http://www.educadist.buap.mx/libros/Microplacas/Portada.htm