Ensayos inmunológicos

 

Los ensayos inmunológicos se basan en la especificidad de la unión Ag.- Ac.

En base a esta unión podemos dosar y caracterizar toda sustancia que pueda generar anticuerpos específicos contra ella.

 

Antígenos (Ag)

 

Se denomina antígeno (Ag.) a toda sustancia que, introducida en  un organismo competente, provoque una respuesta inmunitaria, estimulando la producción de anticuerpos o de células sensibilizadas.

Se trata en general de moléculas complejas con grupos determinados, los cuales constituyen zonas restringidas que determinan la especificidad, estas zonas se denominan determinantes antigénicos o epitopes.

Dado que en una molécula antigénica existen varios epitopes diferentes, de ahí que se diga que un Ag. es polivalente , la inoculación de ésta originará en el receptor anticuerpos con distinta especificidad, cada uno de los cuales provendrá de un clon celular distinto ( respuesta policlonal)

El número de determinantes antigénicos constituye la valencia del Ag.

Esta puede ser:    valencia total = nº total de epitopes

                           valencia  funcional = nº de epitopes expuestos, es decir disponibles para ser captados por el sistema inmune del  huesped.

Los Ag. tienen 2 características básicas:

 

      1º Inmunogenicidad: capacidad de generar Ac.

      Especificidad : capacidad de unirse a ellos.

Existen moléculas que no son inmunogénicas por sí mismas pero sí son capaces de unir específicamente Ac, estas moléculas se denominan Haptenos ( ej. para aminobenceno, dinitro fluor benceno y Ac. sulfanílico).

 

Características de las que depende la antigenicidad:

-PM: debe ser mayor de 10KD, sin embargo hay moléculas como la de la insulina

( PM:6KD) y el glucagon (PM: 3.8KD) que pueden generar RI si son inoculadas con un adjuvante.

Otras sustancias de bajo PM  como es el caso de los haptenos en cambio, deben inyectarse acopladas a una molécula inmunogénica llamada carrier para transformarse así en antigénicas.

- Inmunogenicidad de especie: por ej. los polisacáridos neumococcicos son buenos inmunógenos para el hombre pero no para el conejo.

-Relación  propio-no propio: para ser inmunógeno, un Ag. no debe pertenecer a la especie animal de la cual se pretende obtener la  respuesta inmune hacia él.         

-Grupos químicos: - los radicales ácidos o básicos fuertes en las proteínas las hace mas inmunogénicas (principalmente los ácidos).

- la presencia de aminoácidos como tirosina o fenilalanina, ( la gelatina no los posee y por ello solo es antigénica cuando se inyecta con adyuvante).

-Rigidez de la molécula: las largas cadenas de las moléculas de los hidratos de carbono son fácilmente distorsionables y por lo tanto no generan una buena respuesta inmune. La alta especificidad de los grupos aromáticos en los aminoácidos de síntesis es debida a la rigidez del benceno. A su vez la posición de estos grupos también es significativa para la especificidad dado que los derivados D o L pueden diferenciarse serológicamente. 

La mayoría de los antígenos son proteínas de alto PM, con aminoácidos particulares (sobre todo con grupos aromáticos) y estructura definida.

En los hidratos de carbono la antigenicidad esta dada por la condensación de 2 o más grupos de hexosas.

Los ácidos nucleícos se tornan antigénicos sí se les rompe la doble hélice por ej. por calentamiento y enfriamiento rápido.

Los ácidos grasos no son antigénicos pero si los son los lípidos complejos sobre todo los asociados a glúcidos y proteínas ( ej. lipopolisacáridos).

En orden de antigenicidad tendríamos:

 

1º proteínas

2º hidratos de carbono

3º lípidos ( principalmente fosfo y gluco-lípidos) y ácidos grasos.

 

Ag. bacterianos :

     - Pueden ser la parte constitutiva del microorganismo:- proteínas frecuentemente situadas en la membrana celular y el espacio periplásmico.

                                                                                           - Hidratos de carbono, los cuales constituyen sobre todo los Ag. de superficie. En el caso de las enterobacterias son complejos glúcido-fosfolípidos que constituyen la pared celular y se denominan endotoxinas, su toxicidad se pone en evidencia cuando se produce una masiva destrucción bacteriana dentro del huesped.

Otro tipo de Ag. bacteriano lo constituyen las exotoxinas, estas son generalmente proteínas antigénicas con marcado poder tóxico que son volcadas al medio por el microorganismo. Son Ag. eficaces a pequeñas dosis y pueden ser neutralizados por los Ac. que genera, ( toxina botulínica, toxina tetánica) .

 

 

Anticuerpos (Ac.)

 

Los anticuerpos son proteínas séricas pertenecientes al grupo de las gamma-globulinas o inmunoglobulinas, constituidas por la asociación de cuatro cadenas polipeptídicas unidas entre sí mediante puentes disulfuro, dos cadenas se denominan pesadas y las otras dos ligeras. A su vez, cada una de las cadenas ligeras y pesadas, incluye una región variable, cuya secuencia de aminoácidos es peculiar de cada anticuerpo, y una región constante, con la misma secuencia en todos los anticuerpos.

Existen 5 clases: IgM;  IgG; IgA;  IgD e  IgE

 

La estructura básica de un Ac. Se puede esquematizar con la estructura de la IgG

( Fig.1):

 

Fig.1

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 


Los sitios de unión al Ag. son 2 por eso se dice que un Ac. es bivalente y se denominan paratopes, estos se ubican en la zona variable de la molécula .

 

 

Reacción antígeno-anticuerpo in vitro.

 

La unión antígeno-anticuerpo depende de la complementaridad entre ambas moléculas. En el sitio del determinante antigénico y en el  de combinación del anticuerpo hay estructuras que se corresponden (modelo llave-cerradura), cada anticuerpo reconoce y se une al antígeno que le dio origen. Esta complementaridad o especificidad no sólo está dada por la estructura primaria de la molécula sino también, en algunos casos, por la secundaria y terciaria.

Las fuerzas de esta  unión no son de tipo covalente sino más lábiles (uniones electrostáticas, puentes de hidrógeno , fuerzas de Van der Waals) , de manera que permiten, en ciertas condiciones, la disociación de los complejos.

 

En la interacción in vitro de un Ag. con su correspondiente Ac. se distinguen 2 etapas:

 

1º Interacción primaria: es la mera unión de un Ag. y su correspondiente Ac. No es visualizable directamente y no  es demasiado influenciada por  la temperatura, la concentración salina o la fuerza iónica  ni la agitación. Sólo depende de la complementaridad ya que cuando mayor sea ésta mayores serán las fuerzas de unión 

( afinidad)  y menores serán las fuerzas de repulsión (ej. repulsión estérica).

Los ensayos inmunológicos basados en la interacción primaria son, por ej. ELISA, RIA (radioinmunoensayo), IF (inmunoflorescencia).

En estos ensayos la visualización del complejo se hace marcando uno de los reactivos

( Ag. o Ac.),  con alguna sustancia detectable.

En el caso del ELISA  ( Fig.2), la marcación se realiza con una enzima como por ej. la peroxidasa, de manera que al agregar un  cromógeno y el sustrato de dicha enzima, se

puede calcular la cantidad de complejos formados midiendo la intensidad del color producido.

 


Fig 2

 

 

En el RIA, (Fig. 3) la marcación es por un isótopo radiactivo, de manera que en este caso medimos radiación asociada al complejo.

 

Fig. 3


En IF (inmuno fluorescencia) marcamos con una sustancia fluorescente.

Podemos hacerlo directamente sobre un corte de tejido, impronta etc. y la observación se realiza directamente con microscópio de fluorescencia.

También podemos marcar una suspención celular, en cuyo caso la medición se hará por ej. por citometria de flujo, esta técnica se usa actualmente en clínica para cuantificar células inmunes en el monitoreo del HIV,  

Todas las técnicas de interacción primaria pueden ser Directas : marcamos uno de los reactivos del complejo.

                                                                                 Iindirectas: la marca estará en un 2º Ac. dirigido contra alguno de los componentes del  complejo.Esta es mas sencible que la anterior ya que al aumnetar el tamaño del sistema podemos detectar menores cantidades.

 

Marca

 

Marca

 

2º Ac.

 

1º Ac.

 
Fig.4

Directo

 

Indirecto

 

 


                                                                                                       

 

2º Interacción secundaria: sigue a la anterior, los complejos iniciales que se forman rápidamente y sobre los cuales la temperatura y la concentración salina no tienen demasiada influencia, se agregan para dar diferentes fenómenos visibles cuya característica dependerá principalmente de la naturaleza del antígeno.

Esta etapa se acelera con la temperatura, la agitación y es dependiente de la concentración de electrolitos.

 

Las reacciones de interacción secundarias son:

 

Para Ag. solubles:

 

Precipitación:

En este caso el antígeno es una molécula soluble y al ponerse una solución del mismo, en contacto con los anticuerpos que originó, se forman complejos Ag-Ac que al insolibilizarse  en su mayor parte, dan una reacción de precipitación.

 Esto se da en 2 etapas, la primera se desarrolla rápidamente formándose los complejos Ag-Ac, esta etapa es influenciada muy poco por la temperatura, la concentración de electrólitos y la agitación.

En la 2º etapa los complejos se agregan formando micelas o redes que al alcanzar determinado tamaño precipitan. Esta etapa se acelera con el aumento de la Tº (se la lleva a cabo normalmente a 37ºC) y es además dependiente de la concentración de electrolito ( se usa generalmente ClNa 0,15M) . Es mucho más lenta que la anterior. 

La formación de estas redes esta dada por la bivalencia del Ac. y la polivalencia del Ag., esta polivalencia se debe, como ya mencionamos, a  la presencia de distintos determinantes antigénicos.

Los sueros inmunes obtenidos de animales inoculados con este tipo de Ag. poseen una mezcla de Ac. cada uno de los cuales interacciona con un epitópe distinto (antisuero policlonal). Con  Ac. monoclonales en general no se produce precipitación, esto es porque en la mayoría de los casos están dirigidos contra un único epitope de manera que para el caso el Ag. será monovalente, y solo se evidencia el fenómeno cuando se trata de Ag. con epitopes muy repetidos.

Con haptenos monovalentes o Ag. que posean un solo determinante antigénico, o cuando los Ac. son funcionalmente monovalentes como es el caso de los anticuerpos asimétricos tampoco se formará precipitado.

Como se dijo anteriormente, la aparición de precipitado se produce cuando las redes de complejos Ag. Ac. alcanzan un determinado tamaño.

Si en una serie de tubos colocamos cantidades constantes de uno de los reactivos ( por ej. el Ac.  y en cada uno cantidades variables del otro ( en este caso Ag.) veremos que  se producen distintas cantidades de  precipitado en cada tubo, existiendo en algunos de ellos la máxima cantidad posible para el caso.

Esto se da porque la formación de una red óptima depende de la relación molecular entre Ag. y Ac. y esto va a depender de la cantidad de determinantes del Ag., ya que los Ac. siempre son bivalentes.

           

Fig.5                              Curva de precipitación:

 



Como vemos en la curva a medida que aumentamos la cantidad de Ag.  aumenta la cantidad de precipitado, llegando a una zona donde  este es máximo; esta es la llamada zona de equivalencia y representa la proporción molecular óptima de cada reactivo, necesaria para  generar la red de mayor tamaño.

Al seguir aumentando la concentración  de Ag. que la cantidad de precipitado vuelve a disminuir, esto es porque, otra vez, abandonamos la relación de equivalencia y los complejos tienen menores tamaños. 

Hay que tener en cuenta que si en una mezcla existen más de un sistema Ag-Ac los precipitados de cada uno de ellos se encontrarán juntos en el fondo del tubo siendo imposible distinguir uno de otro; lo que vamos a notar es que el pico de la curva en estos casos será menos neto ya que se van a solapar distintas zonas de equivalencia.

 

Los tipos de reacciones de precipitación son:

 

           a)    En medio líquido:

                                                                Cualitativa: se usa poco ya que existen mejores métodos para detectar presencia o ausencia, además, debido a lo que mencionamos antes sobre la posible existencia de mas de un complejo en la mezcla, para utilizar este método debemos asegurarnos de que uno de los reactivos este puro.

                                                               Semicuantitativa: tampoco se usa, constituye un método poco práctico.

                                                               Cuantitativa: esta es la primera  técnica que permitió medir en masa la cantidad de Ag. o Ac. presente en una solución.

Por ej. queremos medir la masa de Ac. anti neumocóccico en un suero.

Disponemos del polisacárido purificado (esto es importante para asegurarnos de tener un solo sistema reaccionante). Se colocan en una serie de tubos cantidades crecientes del antisuero y constantes del polisacárido, se incuba la mezcla 1hr a 37ºC y luego se centrifuga, lavamos el precipitado para eliminar las proteínas contaminantes y lo resuspendemos, finalmente medimos la cantidad de  proteínas por ej. por absorbancia a 280nm. En este caso como el Ag. no es proteico, la medida obtenida corresponderá solo a los Ac. presentes en el suero.

Si ambos reactivos  fueran proteicos, el cálculo se haría restando la cantidad agregada del reactivo conocido.

Para obtener la masa debemos tener una curva de calibración: masa de proteína vs DO y, a partir de la DO medida en nuestros tubos, obtenemos la masa incognita.

La medición de DO se realiza en el tubo de máximo precipitado, donde sabemos que todo el Ag. y Ac. presentes formará parte del mismo.        

 

 

          b)   En medio sólido ( precipitación en gel) :

 

Se usa como soporte de la reacción un gel de manera que las  moléculas difundirán libremente a través de él de manera que, a lo largo del recorrido se irá formando un gradiente de concentraciones que hará que en un determinado punto los reactivos se encuentren  en su relación de equivalencia, en ese punto se producirá un precipitado que sobre el gel se verá como una nítida banda blanca que permanece estable mientras un mayor flujo de reactantes no provoque su re disolución.

Como se recordara, en la precipitación en medio líquido no era posible distinguir en el precipitado la presencia de más de un sistema reaccionante, en el caso de que las moléculas estén disueltas en un medio gelificante sumamos a los fenómenos de la precipitación, los de la difusión simple, de manera que aquellos complejos cuyos coeficientes de difusión sean distintos formaran bandas en distinta posición. De esta manera podemos resolver la existencia de más de un complejo reaccionante en la mezcla. Sin embargo no podremos separar complejos con igual coeficiente de difusión, y decimos que cada banda que se forme estará compuesta por lo menos por 1 sistema .

Como soporte se usan medios semi sólidos como agar blando (agar 1% en solución salina) agarosa 0,5% etc. Todos aquellos que permitan una libre difusión de macromoléculas.

 

La precipitación en gel puede ser:

 

                                                   Cualitativa: existen diferentes esquemas que nos permiten detectar la presencia de un Ag. o un Ac. (según el caso).

 

 - Difusión simple monodimensional ( método de Oudin): Se coloca en un tubo de ensayo agar fundido mezclado con un vol. igual del antisuero a analizar (en este caso queremos detectar la presencia de un Ac.)

Se deja solidificar y  se añade la solución de Ag., este va a difundir por el agar formando, como dijimos, un gradiente de concentración decreciente hacia el fondo del tubo, significa que en determinada zona Ag. y Ac. alcanzarán la relación de equivalencia, formándose ahí la banda de precipitado.

Se formarán tantas bandas como sistemas haya, siempre que la velocidad de difusión sea distinta para cada uno de ellos.

Se ha intentado utilizar este sistema con fines cuantitativos, ya que la distancia a la que se forma la banda es directamente proporcional a la concentración del reactivo que difunde, entonces mediante distintas fórmulas matemáticas se puede calcular la concentración en función de la distancia recorrida.

 - Difusión doble monodimensional ( método de Oakley Fulthorpe): En este caso colocamos en la parte inferior del tubo un vol. de agar 1% fundido, mezclado con un vol. igual del antisuero, dejamos solidificar y agregamos igual vol. de agar 0,5%, dejamos solidificar y por ultimo agregamos agar 1% donde se encuentra disuelto el Ag.

Tanto el Ag. como el Ac. migrarán hacia la zona media de menor concentración, de manera que, otra vez, se formarán gradientes que harán que en deteminado punto los reactivos estén en equivalencia y precipiten.

Vemos acá, que si la concentración de Ag. y Ac. están en relaciones óptimas (equivalentes) la banda se formará en un punto intermedio del tubo, mientras que si, por ej. la cantidad de Ag. esta en exceso necesitará recorrer una mayor distancia para alcanzar una dilución tal que se encuentre en equivalencia con el Ac. y así la banda se formará más cerca del fondo. Lo contrario ocurrirá cuando la cantidad de Ac. sea la que esta en exceso.

 

Fig. 6

 


 - Difusión doble bidimensional (método de Oüchterlony) : Constituye un método muy completo ya que permite obtener mas información que los anteriores.

Consiste en colocar en una placa de Petri agar 1,5% al cual luego de solidificar se le realizan perforaciones en forma de pocillos a distancia conveniente y en dichas perforaciones se colocan pequeñas cantidades de Ag. y Ac.

En este caso los reactivos difunden en forma radial a partir del pocillo generando bandas de precipitación cuyas características dependerán de varios factores.

 

 

Fig.7


 

Igual que en el caso anterior, cuando las concentraciones colocadas en los pocillos estén cerca de la de quivalencia la banda se formará a mitad de distancia entre ellos.

 Además, nos permite tener idea de los PM  de cada reactivo ya que al tratarse de una difusión radial, la concavidad de la banda estará hacia el lado del pocillo donde se halla colocado el reactivo de mayor PM,  y viceversa,  si ambos PM son semejantes la banda será recta.

Por otro lado, la posibilidad de hacer varios pocillos en una placa permite obtener información sobre similitud de los Ag. reaccionantes.

Recordemos que las macromoléculas antigénicas tienen en su superficie zonas llamadas determinantes antigénicos y que son los sitios reconocidos por el Ac.

Así, dos Ag. emparentados ( por ej. dos albúminas de distinta espécie) tendrán probablemente determinantes antigénicos comunes a ambos.

Mediante la técnica de Ouchterlony podemos determinar la existencia o no de determinantes comunes entre Ag. según las características de las bandas formadas.

        

Fig.8

 


 

             

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 


La reacción de identidad (I), corresponde a los Ag. que comparten todos los determinantes antigénicos, es decir que estamos ante la misma molécula, en la de no identidad (II), ningún determinante es compartido y por lo tanto son Ag. distintos mientras que en la identidad parcial ( III), hay determinantes en común, o sea que hablamos de Ag. emparentados, esto se ve como un espolón dirigido hacia el pocillo con menos determinantes reactivos. Notese que en este caso último,  ab es una sola molécula

Acá, otra vez nos referimos a un sistema reaccionante con un determinado coeficiente de difusíón. En caso de que los sistemas sean varios tendremos tambien distintas bandas según las velocidades de difusión de cada uno. Esto nos va a permitir determinar la pureza de una solución antigénica, recordando siempre que cada banda corresponderá a, por lo menos, un sistema.

 

Fig.9


En este esquemas vemos, en el caso I, que en el pocillo ac , hay 2 sistemas reaccionantes (a y c) uno de los cuales ( a) presenta  reaccion de identidad con el otro pocillo a (ya que se trata del mismo Ag.), mientras que el sistema c da una banda separada ( es decir que su concentración y su coeficiente de difusión son distintos, por lo tanto es otra molécula antigénica).

En el caso II, se enfrenta la solución ab con la solución b, acá vemos la banda de no identidad correspondiente a los Ag a y b de cada pocillo, y la banda de identidad correspondiente  a b, presente en los dos. La diferencia con el caso I radica en que en II, a esta en mayor concentración relativa de lo que esta c en el  I.    

En el esquema III, vemos la identidad parcial de ab y b, y las bandas c y d que no presentan identidad ni con a ni con b. Notese que en este último caso ab es tambien una sóla molécula.

 

Evaluacón de los pasos de purificación de albumina sérica humana.


Fig. 10

Otra utilidad de este método es la de testear los pasos de purificacion por ej. de una proteína , a partir del material a purificar ( 1) vemos la desaparición de bandas en los distintos pasos, asi el resultante del  1º paso, pocillo 2, presenta  una banda menos que el 1, y en el pocillo 3 ya vemos solamente la banda continua correspondiente a la albúmina, es decir que el paso 4 no sería necesario. En el pocillo central debemos colocar un antisuero total que nos revele todas las proteínas del suero a purificar. En este ejemplo será antisuero humano total.

Como control debemos colocar un pocillo con albumina humana purificada para verificar su identidad con la banda presente en el ultimo paso de purificación.  La banda de albumina esta representada por la linea continua que rodea el pocillo central. 

 

                                                    Semicuantitativo:En este tipo de pruebas se busca determinar la cantidad de un determinado reactivo .

Cuando la cuantificación es relativa, el resultado depende del método usado, los reactivos empleados etc., entonces hablamos de ensayos semicuantitativos.

En inmunología el resultado de estos ensayos se expresan como “título”.

El título se define como la inversa de la última dilución que da resultado positivo.

La metodología empleada consiste en colocar sobre un porta objetos, agar 1,5% en sol. fisiológica y sobre él realizar perforaciones delimitanto pocillos en los que se colocarán los reactivos, uno de ellos en concentración constante y el otro, el que se va a cuantificar, en diluciones crecientes.

 

 

Fig. 11

 

     TC              1/2            1/4             1/8           1/16         1/32

 
 

 

 

 

 

 

 

 

 


En este caso, el título del antisuero 1 es 8, y el del anti suero 2 es 4.

 

 

                                                      Cuantitativo: En estos casos la cuantificación se realiza en masa, es decir que el resultado obtenido no debe variar de una técnica a otra ya que representa una medida absoluta.

La técnica de precipitacion usada en este caso es una difusión simple  en placa o inmunodifusión radial ( Mancini ).

Consiste en una placa de agar o agarosa al 3% en solución salina,  en el que se encuentra disuelto el Ac.Sobre el agar se realizan perforaciones en las que se colocan las muestras a dosar.

Como mencionamos en párrafos anteriores, la distancia a la que difunde un Ag. hasta alcanzar la relación de equivalencia con su correspondiente Ac. y precipitar, es proporcional a la concentración del  mismo. Entonces, cuando los sistemas son equivalentes, aparece alrededor del pocillo un circulo de precipitación.

Debido a que la concentración del reactivo disuelto en el agar es constante,  el diámetro del círculo descripto por la banda de precipitación será directamente proporcional a la concentracion del reactivo que difunde.

Para realizar el ensayo, se colocaran en una serie de pocillos cantidades conocidas de un estandar del Ag. a dosar y en los otros la o las muestras incógnitas.

Luego se incuba la placa a temperatura ambiente hasta que el diámetro de los halos no se modifique (48-72 hs).

Se mide el diámetro de los halos y con aquellos correspondientes a los estandares se construye una curva de calibración relacionando la superficie de los mismos (el r2 o d2) con la concentración. Con la medida de los halos de las muestras incógnitas y mediante esta curva, se calcula la concentración de las mismas.

Este método, en el cual  el precipitado alcanza su punto de equilibrio y ya no se modifica, constituye la llamada determinación de alta precisión.

Se puede realizar una determinación rápida de orientación  en la cual se incuba la placa entre 16 y 20 hs. y se gráfica diámetro vs. log de la concentración de Ag.

                                         

 

 

  Fig. 12                                 Curva de calibración

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 


Existen kits comerciales que traen la placa con el Ac. ya incluido en ella , un estandar de concentración conocida y una tabla de concentración en función de los diámetros o radios; de manera que sólo sembramos ese estandar y nuestras muestras. Al cabo de la incubación medimos el halo del estandar para verificar que corresponda a la concentración establecida y, si es así, sólo medimos los halos de nuestras incognitas y con esto obtenemos la concentración en la tabla adjunta. 

 

 

Para antígenos particulados:

 

Aglutinación:

En la reacción de aglutinación, los principios son los mismos que en la precipitacíón, la diferencia radica en que en este caso el Ag. no es soluble sino particulado ( ej.  bacterias, células,  glóbulos rojos etc.) 

La formación de las redes dará como consecuencia  agregados en forma de grumos en el fondo del tubo. El Ag. no se encuentra en solución sino en suspensión y al ser una partícula grande, se formen o no los agregados, sedimentará; la diferencia entre una reacción negativa, donde lo que vemos en el sedimento es sólo el Ag. y una positiva, donde se forman los complejos,  esta dada por la característica visual del sedimento que, en el primer caso será un botón homogeneo de células y en el segundo serán  grumos.

 

 

  Fig. 13                                                             Placa de hemoaglutinación

 

Sedimentación

 

Aglutinación

 
                            

 

 

Cuando el anticuerpo está dirigido contra antígenos constitutivos de la partícula, se trata de una aglutinación directa, por ejemplo la determinación de grupos sanguíneos o la detección de Ag. bacterianos, mientras que la interacción del anticuerpo con un antígeno soluble cualquiera acoplado a una partícula inerte o  a una célula, como por ej. un glóbulo rojo, se denomina aglutinación pasiva. Esta es más sensible que la  directa debido a la posibilidad de regular la densidad de los determinantes sobre la superficie de la partícula.

 

La aglutinación puede ser:

                                                        Cualitativa: es la típica reacción de determinación de grupo sanguíneo, donde se ponen en contacto la sangre a determinar con sueros de distintos grupos, y se considera la producción o no de aglutinación.

 

 

 Fig. 14


 

                                                    Cuantitativa: no es muy usada, al igual que en la precipitación cuantitativa, consiste en medir proteínas en el aglutinado; se puede utilizar por ej. para determinar los mg de anticuerpo contra un Ag. particulado, presente en un suero inmune.

Para esto, se determina   por micro Kjeldahl, el nitrógeno proteico correspondiente a un volumen determinado de antígeno puesto en contacto con el suero inmune y por otro lado, el nitrógeno correspondiente al mismo volumen de Ag. puesto en contacto con un suero normal de la misma espécie animal. La cantidad de proteína correspondiente al Ac. específico sera la diferencia entre ambas mediciones multiplicada por el factor de conversión 6,25.

Como en el caso de la precipitación, previo a la medición de N, hay que lavar el aglutinado para eliminar toda proteína no fijada específicamente y además, como se trata de células se coloca EDTA para inhibir la fijación de complemento.    

 

                                                   Semicuantitaviva: esta técnica se realiza normalmente en microtubos o placas de fondo en U y consiste, al igual que en el caso de la precipitación, en colocar concentraciones constantes de uno de los reactivos en contacto con concentraciones variables del reactivo a determinar. Asi, obtenemos el título, que será, igual que en todo ensayo semicuantitativo, la inversa de la mayor dilución que da un resultado positivo.

Debemos recordar que se trata de una medición relativa y no absoluta, por lo cual puede variar de laboratorio en laboratorio y siempre debe ir acompañada de un control positivo y otro negativo, realizado en el mismo laboratorio y por el mismo método.

Es una técnica muy útil, rápida y económica para determinar Ag. bacterianos y de hecho, se la usó para clasificar serológicamente enterobacterias como por ej. las del               género Salmonella.

 

 

Fig. 15

 

 


En  todos los pocillos se coloca la suspensión bacteriana a concentración constante y a continuación en las filas A,B,C, etc. Se colocan diluciones crecientes al medio de los antisueros anti bacteria que se quieren dosar.

Debemos colocar como control negativo un suero normal ( no inmune) de la misma especie en la que se hizo el antisuero para comprobar que la reacción  que se produce no es una aglutinación inespecífica. (Fila E). 

Como vemos en la figura 15, el antisuero de la fila A da reacción de aglutinación hasta el pocillo Nº7, si comenzamos en el 1 con concentración tal cual, el 7 seria 1/64, es decir que el título sería 64.

El antisuero B da un título de 4 y el C, de 8.

El antisuero D no tiene anticuerpos contra dicha bacteria. 

 

La reacción de las enterobacterias frente a antisueros específicos depende de 3 tipos de Ag.:

H: Ag. flagelar: es una proteína fibrosa del tipo de la miosina.

O : Ag. somático: está formado por un polisacárido específico, una proteína y un fosfolípido. Se presenta como una masa de “barbas” de longitud variable cada una de las cuales se une al lípido A a través de una cadena nuclear.

Vi: También conocido como “de virulencia”, se trata de una capa externa de  polisacáridos, ésta no es tan densa como una cápsula y no llega a cubrir completamente al Ag. O. La presencia del este Ag.  permite la absorción y neutralización con los sueros anti-O, pero la aglutinación sólo será posible con sueros ant-H o anti-Vi.

 

Fig 16

Ag.H

 

Ag. O

 

Ag. Vi

 
 

 



                 Fig. 17                   Características del Ag. O.

 

    Esquema de la membrana celular de las bacterias gram negativas


El LPS es la porción de la menbrana celular de las bacterias gram negativas que se conoce como endotoxina. Puede extraerse de las células intactas y ser separado por hidrólisis en un lípido A y un polisacárido ( constituyente del Ag.O ) que es el responsable de la especificidad antigénica. En las enterobacterias, el LPS proporciona centenares de Ags. O diferentes de importancia diagnóstica y cuya variación constituye la base principal para la clasificación de las Salmonellas.

El polisacárido contiene colectivamente una gran variedad de azúcares, cinco de ellos son comunes a todos los tipos salvajes de Salmonella. Estos azúcares comunes forman un centro polisacárido nuclear constante al que se añaden los residuos O específicos.

La especificidad esta dada por los distintos azúcares solos o combinados que forman así el determinante antigénico, cada uno de los cuáles se indica con un número arábico, por ej. una manosa +una galactosa forman el determinate 15.

Cada Ag. O de Salmonellas poseen 2 o 3 determinantes específicos, cada uno de los cuales es compartido por otros Ags. O, uno de ellos, llamado determinante principal, es el de reacción mas fuerte y en base a éste se divide a las Salmonellas en grupos:
Ej. grupo C (Ag. O=6,7)  determinante principal=6

      Grupo E (Ag. O= 3,10) det. principal=3    

Mediante los determinantes de menor importancia (de reacción mas débil) de pueden establecer divisiones dentro de cada grupo.

 

Clasificación de las Salmonellas según Kauffmann-White:

 

Si tenemos por ej. dos cepas de Salmonella, a y b, y el antisuero preparado ante cada una de ellas (anti-a y anti-b) y enfrentamos la suspensión de cada una de ellas con esos antisueros y con los mismos antisueros después de ser absorbido con la suspención heteróloga, obteniendo  los siguientes resultados :

     

 

Antisuero                                                      Organismos

 

                                                                       a                          b  

 

Anti-a no absorbido                                       4+                       2+

 

Anti-b no absorbido                                       2+                       4+

 

Anti-a absorbido con b                                  2+                        0

 

Anti-b absorbido con a                                   0                          2+

 

Concluímos que a y b son diferentes pero comparten determinantes antigénicos.

Podríamos decir, por ej., que a tiene los determinantes 1 y 2, y b, los determinantes 2 y 3.

Al absorber un antisuero con una suspensión de bacterias lo que hacemos es capturar los

Ac. que se unan a dicha suspensión y separarlos del resto del antisuero.

Si cada cepa fuera capaz de eliminar todos los Ac. aglutinantes para la otra, concluíriamos que son antigénigamente idénticas, y en ese caso los títuos de cada cepa con cada antisuero serían iguales.

 

Bibliografía:

- Inmunología e inmunoquímica. Ricardo Margni.

- Tratado de Microbiología. David Dulbecco.